Хімія. Нінгідринова реакція

При дослідженнях речовин в органічній хімії застосовується не один десяток різних якісних реакції, що дозволяють визначити зміст тих чи інших сполук. Такий наочний аналіз дозволяє відразу зрозуміти, чи є необхідні речовини, а якщо ж їх немає – суттєво скоротити подальші досліди для їх виявлення. До таких реакцій відноситься і нінгідринова, яка є основною у візуальному визначенні аминосоединений.

Що це таке?

Нингидрин – це дикарбонильное сполука, що містить одне ароматичне кільце з приєднаним до нього гетероциклом, біля другого атома якого знаходяться 2 гідроксильні групи (OH-). Це речовина отримують прямим окисленням инандиона — 1,3, і, отже, за міжнародною номенклатурою воно має наступну назву: 2,2 – дигидроксиинандион -1,3 (рис. 1).

Чистий нингидрин являє собою кристали жовтого або білого кольору, які при нагріванні добре розчиняються у воді і інших полярних органічних розчинниках, наприклад, в ацетоні. Це досить шкідлива речовина, при попаданні на шкіру у великих кількостях або слизові оболонки викликає подразнення, у тому числі і при вдиханні. Працювати з цим з’єднанням слід обережно і тільки в рукавичках, так як при попаданні на шкіру дає реакцію з білками клітин шкіри і забарвлює її в фіолетовий колір.

Речовини, що піддаються реакції

Як було зазначено вище, нінгідринова реакція використовується в першу чергу для візуального визначення змісту аминосоединений:

  • α-амінокислот (в тому числі і в білках);
  • аміноцукрів;
  • алкалоїдів, які містять –NH2 і -NH групи;
  • різних амінів.

Слід відзначити, що вторинні і третинні аміни іноді реагують дуже слабо, тому щоб підтвердити їх наявність, необхідно проводити додаткові дослідження.

Для кількісного визначення використовуються різні методи хроматографії, наприклад, паперова (БХ), тонкошарову (ТШХ) або з промиванням твердих носіїв розчином нингидрина в різних середовищах.

Дана реакція не є специфічною по відношенню до аминосоединениям, так як вступати в неї реагент може з усіма відразу. Однак з боку продуктів реакції вона має особливість у вигляді виділення бульбашок вуглекислого газу (CO2), а це характерно тільки при взаємодії з α-амінокислотами.

Особливості механізму

У літературі зустрічаються різні трактування рівняння нингидриновой реакції. Якісь дослідники опускають освіта гидриндантина з 2-аминоинандиона, який за участю аміаку і нингидрина також утворює барвник під назвою «пурпурний Руэмана» (або «синій Руэмана»), а інші, навпаки, припускають тільки його участь без присутності проміжних аминопродуктов. У записі самої реакції також є деякі цікаві моменти, особливо це стосується способів приєднання аминопроизводного нингидрина до основної його молекулі з утворенням барвника. Також залишається під питанням зазначення місця «гулящого водню», отриманого проміжним аміном з водного середовища: воно може бути або в кетоновой групі, або поруч з –NH2.

Насправді нюанс з атомом H незначний, так як його становище в з’єднанні не грає особливої ролі в ході реакції, тому на нього не варто звертати увагу. Що стосується пропуску однієї з можливих стадій, то тут причина криється в теоретичному аспекті: досі точний механізм утворення пурпурного Руэмана точно не визначений, тому можна зустріти досить різні схеми нингидриновой реакції.

Нижче буде запропоновано найбільш повний можливий хід взаємодії реактиву з аминосоединениями.

Механізм реакції

Спочатку нингидрин взаємодіє з α-амінокислотою, приєднуючи її за місцем відщеплення гідрокси-груп і утворюючи продукт конденсації (рис. 2а). Потім останнє руйнується, виділяючи проміжний амін, альдегід і вуглекислий газ (рис. 2б). З кінцевого продукту при приєднанні нингидрина синтезується структура пурпурного Руэмана (дикетонгидринденкетогидринамин, рис. 2в). Також зазначено можливе утворення з проміжного аміна гидриндантина (відновлений нингидрин), який в середовищі аміаку (а точніше, гідроксиду амонію) з надлишком самого реактиву теж перетворюється в барвник з’єднання (рис. 2г).

Освіта гидриндантина було доведено самим Руэманом при дії сірководнем на молекулу нингидрина. Це з’єднання здатне розчинятися в карбонате натрію Na2CO3, забарвлюючи розчин у темно-червоний колір. А при додаванні розведеної соляної кислоти гидриндантин випадає в осад.

Швидше за все, проміжний амін, гидридантин, нингидрин і структура барвника з-за своєї нестійкості при нагріванні знаходяться в деякій рівновазі, що дозволяє припустити наявність декількох додаткових стадій.

Даний механізм підходить для пояснення нингидриновой реакції і з іншими аминосоединениями, виняток становлять побічні продукти, що утворюються в результаті відщеплення частини структури від –NH2, -NH або -N.

Біуретова проба і інші реакції на білки

Якісний аналіз на пептидні зв’язки навіть непротеиновых структур може проходити не тільки з участю вищеописаного реактиву. Однак у випадку нингидриновой реакції на білки взаємодія відбувається не по –CO-NH‒ групами, а по амінова. Існує так звана біуретова реакція», яка характеризується додаванням в розчин з аминосоединениями іонів двовалентної міді CuSO4 або Cu(OH)2 в лужному середовищі (рис. 3).

В ході аналізу при наявності необхідних структур розчин забарвлюється в темно-синій колір завдяки зв’язування пептидних зв’язків в кольоровий комплекс, що відрізняє один реактив від іншого. Ось чому біуретова і нінгідринова реакції є універсальними по відношенню до білкових і небелковым структурам з групою –CO-NH‒.

При визначенні циклічних амінокислот використовують ксантопротеиновую реакцію з концентрованим розчином азотної кислоти HNO3 , яка при нитровании дає жовте забарвлення. Крапля реактиву, що потрапила на шкіру, також проявляє жовте забарвлення, реагуючи з амінокислотами в клітинах шкіри. Азотна кислота може залишати опіки, тому з нею слід працювати в рукавицях.

Приклади взаємодії з аминосоединениями

Нінгідринова реакція на α-амінокислоти дає хороший візуальний результат, за винятком кольору є пролиновые і оксипролиновые структури, які реагують з утворенням жовтого забарвлення. Можливе пояснення цього ефекту знайшли в інших умовах середовища взаємодії нингидрина з даними структурами.

Реакція з аміногрупою

Так як проба не специфічна, візуальне виявлення аланіну з допомогою нингидриновой реакції в суміші не представляється можливим. Проте методом паперової хроматографії, при нанесенні зразків різних α-амінокислот, їх обприскування водним розчином нингидрина і проявом в спеціальному середовищі, можна розрахувати кількісний склад не тільки заявленого з’єднання, але і багатьох інших.

Схематично взаємодія аланіну з нингидрином проходить по тому ж принципу. Він приєднується до реактиву за амінова групі, а під дією активних іонів гидроксония (H3O+) відщеплюється за місцем зв’язку вуглецю з азотом, розпадаючись на оцтовий альдегід (CH3COH) і вуглекислий газ (CO2). Інша молекула нингидрина приєднується до азоту, витісняючи молекули води і утворюється фарбувальна структура (рис. 4).

Реакція з гетероциклическим аминосоединением

Нінгідринова реакція з пролін є специфічною, особливо в хроматографічних аналізах, так як такого роду структури в кислому середовищі спочатку забарвлюються в жовтий колір, а потім у нейтральній набувають пурпурове забарвлення. Дослідники пояснюють це особливістю перебудови циклу в проміжному з’єднанні, на який впливає саме присутність великої кількості протонів водню, доповнюють зовнішній енергетичний рівень азоту.

Руйнування гетероциклу не відбувається, а інша молекула нингидрина приєднується в ньому по 4-го атома вуглецю. При подальшому нагріванні отримана структура нейтральному середовищі переходить у пурпурний Руэмана (рис.5).

Приготування основного реактиву

Нингидриновую пробу проводять різними розчинами, залежно від розчинення аминоструктур в тих або інших органічних і неорганічних сполуках.

Основним реактивом є приготування 0,2 % розчину у воді. Це універсальна суміш, оскільки більшість сполук добре розчиняються саме в H2O. Щоб отримати свіжоприготований реактив, наважку 0,2 г хімічно чистого нингидрина розбавляють в 100 мл води.

Варто зазначити, що для деяких аналізованих розчинів ця концентрація є недостатньою, тому можуть приготувати 1 % або 2 % розчини. Це характерно для витяжок з лікарської сировини, оскільки в них містяться різні класи аминосоединений.

При проведенні хроматографічних досліджень розчини, наприклад, при промиванні суміші на твердому носії через колонку, можуть готувати на спирту, диметилсульфоксиді, ацетоні та інших полярних розчинниках ‒ все буде залежати від розчинника певних аминоструктур.

Застосування

Нінгідринова реакція дозволяє виявити в розчині багато аміносполуки, що визначило її як одну з перших для використання в якісному аналізі органічних речовин. Візуальне визначення значно скорочує кількість дослідів, в особливості при аналізі маловивчених рослин, ліків і лікарських форм, а також невідомих розчинів і сумішей.

У криміналістиці цей метод отримав широке поширення для визначення наявності потожировий слідів на будь-яких поверхнях.

Навіть незважаючи на неспецифічність реакції, висновок нингидриновой реакції з хімічної практики неможливий, так як заміни цієї речовини на менш токсичні аналоги (наприклад, оксолін) довели, що вони володіють гіршою чутливістю по відношенню до аминогруппам і не дають добрих результатів при фотометричних аналізах.