21-е століття – це століття, здійснює семимильні кроки в області технологічного прогресу, стрімко розвиваються наука і медицина. Сучасний рівень прогресу дозволяє втілити в життя те, що раніше здавалося людині неможливим. Постіндустріальна стадія розвитку людства націлена на високі технології, інновації у всіх сферах.
Особливо швидко розвивається медицина: більшість хвороб, які раніше вважалися невиліковними, тепер не є такими. Так, наприклад, культивування вірусів дозволяє створювати профілактичні препарати: вакцини і сироватки, що запобігають епідемії чуми, віспи та інших смертельно небезпечних хвороб.
Що таке культивування?
Культивування (від лат. cultivo – обробляти) являє собою процес розведення і вирощування чого-небудь в штучних умовах. У медицині, а точніше в епізоотології – приватному відгалуженні від ветеринарної медицини, культивування є основним процесом, що дозволяє вивчати вплив вірусу на живий організм.
На підставі отриманої інформації фармацевти виготовляють противірусні препарати, створюють методики, що дозволяють у майбутньому протидіяти виявлених мікроорганізмів. Виділення вірусів з зараженого матеріалу також дозволяє зберігати їх для подальшого використання.
Історія епізоотології
Ще в 1879 році французький учений Ст. Гальтье вперше зробив спробу культивувати вірус. Його вибір припав на таке захворювання, як сказ: він виділив неклеточный агент цієї хвороби за допомогою зараження кролика кров’ю хворої собаки.
У 1919 році у німця А. Левенштейна вийшло заразити вірусом герпесу, взятими у людини, кролика. Роком пізніше його співвітчизник Ст. Грютер підтвердив досвід свого колеги і довів, що подібна культивація на кроликах можлива.
У 1925 році двоє вчених – Ф. Паркер і Б. Най – довели, що вірус коров’ячої віспи в стані відтворюватися в тканинах організму тварин. 6-ма роками пізніше Вудрафф і Е. Гудпасчер заявили, що культивація вірусу віспи птахів може проводитися на оболонці курячих ембріонів, тим самим відкривши науковому світові новий метод репродукції вірусів.
Процес зараження клітини
Процес культивування вірусу неможливий без наявності реагує на нього клітини. Коли клітина знайдена (це можуть бути клітини курячих ембріонів, частини тканин, органів або навіть цілі тварини), в неї вводиться нуклеїнова кислота вірусу, яка перепрограмує генетичну інформацію шуканої клітини, замінюючи її своєю. Зазвичай шкідливої частці вдається оселитися в клітці, навіть незважаючи на систему противірусного захисту і виробляються організмом інтерферони.
Після того як вірус проник через мембрану клітини, він починає розмножуватися, проходячи через 3 стадії. Спочатку відбувається транскрипція геному закріпився вірусу, що означає перенесення інформації з системи ДНК в РНК, яка синтезується в прискореному темпі. Наступний етап – утворення і дозрівання білків, які послужать каркасом для дочірніх вірусних тел.
На останньої, завершальної стадії новосинтезированные вірусні тіла збільшуються в кількості. Коли їх стає занадто багато, розривають мембрану і виходять із клітки, в якій спочатку закріпився вірус. Варто зазначити, що освіта віріонів (дочірніх тел даного мікроорганізму) не завжди призводить до загибелі клітини-господаря. Деякі здатні відділятися від мембрани, не викликаючи її розриву, в той час як клітина продовжує виробляти вірусні тіла.
Мікробіологія та її методи
З плином часу біологія, як наука, розвивалася і вбирала в себе нові факти. Поступово ускладнюючись, від неї стали відділятися різні напрямки: біомеханіка, гідробіологія, вірусологія, космічна біологія і багато інших. Такий розділ, як мікробіологія, вивчає процеси життєдіяльності мікроорганізмів, у тому числі і через зараження піддослідного лабораторного тварини вірусом. Таким чином, в мікробіології культивування вірусів вважається одним з основних способів одержання інформації, будучи ключовим інструментом біологічного методу дослідження.
Крім біологічного методу, суть якого полягає в дослідженні дії вірусу на організм тварини і подальшої його культивації, існують і деякі інші. У багатьох випадках шкідливими мікроорганізмами заражають курячі ембріони, оскільки досить велика частка вірусів, відомих на сьогоднішній день науці, здатна правильно саме в цій формі життя. Однак найчастіше біологи в якості робочого матеріалу використовують тканинні культури, оскільки вони найбільш продуктивні в якості методу культивування.
Вірус і тканинні культури
Тканинна культура являє собою певну систему клітин у вигляді суспензії. Це шар певного розміру, зазвичай в одну клітку, який поміщається на скло судини. Частіше інших використовується первинна моношарова тканина. Домогтися монослойности досить важко, спочатку обрану тканина (зазвичай це тканина серця, плаценти або нирок тварин) потрібно подрібнити.
Після подрібнення біологи застосовують розщеплює білок фермент – трипсин, який роз’єднує клітини тканини, знищуючи між ними міжклітинну зв’язок. Після досягнення роз’єднання клітин необхідно відмити їх від ферменту і помістити в живильне середовище, щоб забезпечити зростання вийшла клітинної культури. Даною середовищем може послужити середовище 199, яка характерна високим вмістом глюкози, солей і різних вітамінів. Змінюється живильне середовище після 2-3 днів.
Крім первинної тканини для культивування вірусів також застосовуються так звані перетравлювані тканини, які, в свою чергу, поділяються на нормальні та пухлинні. Вони стійкіші, ніж первинні, і здатні довгостроково розмножуватися. Нормальними тканинами можуть послужити органи тварин: нирки барана, серце мавпи. В якості пухлинних тканин зазвичай беруть клітини HeLa, виділені спочатку раку шийки матки, або клітини Hep-3, взяті з раку лімфи.
Вірус і курячі ембріони
Більшість відомих науці вірусів можна вирощувати в курячих ембріонах. Вони дуже життєздатні і стійкі до негативних зовнішніх впливів. Строк, на якому заражається ембріон, залежить від завдань дослідження і виду вірусу, але зазвичай не перевищує двох тижнів. Так, наприклад, щоб провести культивування вірусу грипу, потрібен 9-10-денний ембріон, а для того щоб виростити вірус паротиту, досить і тижневого ембріона.
При роботі з курячим ембріоном всі його зачатки тканин піддаються зараженню. Результативність культивації можна побачити на фінальній стадії: це може бути загибель ембріона, а також дефекти розвитку у вигляді появи на оболонках ембріона бляшок, що складаються з вірусних часток – віріонів.
У будь-якому випадку даний метод культивування і індикації вірусів має істотний недолік, який полягає в необхідності розтину ембріона для захоплення відтворювального вірусу. Також отримана субстанція має в собі високу концентрацію білка, який потрібно видалити, щоб вивести чистий інфекційний агент для подальшого виробництва медикаментів.
Вірус і організми тварин
В даний час використання лабораторних тварин в якості біологічного матеріалу в силу своєї негуманності обмежено з 1986 року Європейської конвенції про захист хребетних тварин. Незважаючи на це, багато видів тварин: миші та пацюки, тхори і кролі, вівці, собаки і мавпи – все одно використовуються в лабораторних роботах і експериментах, оскільки деякі віруси способи до реплікації тільки в живих організмах.
Культивування вірусів в організмі тварин проводиться по-різному: для відтворення нейротропних вірусів (сказ, енцефаліт) заражається мозок тварини, для створення респіраторних (грип) проводиться интраназальное зараження, для дерматотропных (віспа) – накожное і підшкірне інфікування.
Частіше інших для культивації використовуються гризуни: миші та пацюки, сирійські хом’яки, свинки. Їх заражають нейротропними інфекційними агентами, аденовірусами, лімфоцитарним хориоменингитом допомогою введення шкідливого мікроорганізму в мозок або черевну порожнину.
Деякі шкідливі мікроорганізми набагато швидше розвиваються в тілах молодих особин, тому онкогенними вірусами заражаються в основному новонароджені щури і сірійські хом’яки. Без них неможливо обійтися при культивації вірусів Коксакі. Варто відзначити, що біологічний метод культивування вірусів в мікробіології теж має свої вади. По-перше, організми лабораторних тварин забруднюються вірусами, в силу чого вони відчувають нездужання. По-друге, щоб отримати чистий інфекційний агент, потрібно провести його через інші культури клітин, що збільшує тривалість дослідження.
Показники успіху зараження
Культивування і індикація вірусів – два нерозривних процесу. Індикація дозволяє зрозуміти, чи зміг мікроорганізм ужитися в зараженій клітині і вийшло у нього розвиватися далі. Говорити про факт реплікації можна, якщо у тварини спостерігаються основні ознаки захворювання, а також якщо органи і тканини зазнали патоморфологическим змін. Часто в якості індикації використовується реакція гемаглютинації, яка показує ступінь поширення вірусу на основі виділяється їм білка гемаглютиніну.
Сучасні особливості культивування вірусів
Прогрес не стоїть на місці, у всіх наукових сферах з’являються інноваційні методи, технології. Мікробіологія і вірусологія не є винятком. Тепер замість простого розміщення клітинної культури на судинах застосовується ролерний метод, при якому використовується матеріал знаходиться на декількох циліндричних поверхнях, що обертаються по колу і періодично омиваних живильним середовищем. Цей метод хороший тим, що він збільшує число одержуваних клітин і вимагає менший витрата поживного матеріалу.
Загальний висновок
Культивувати віруси, тобто створювати їх на штучних середовищах, людина почала зовсім недавно. Спочатку заражалися організми тварин з метою вивчення принципу дії інфекційних агентів і вироблення препаратів проти них. Завдяки мікробіології, вірусології та епізоотології людство позбулося таких смертельної небезпеки таких захворювань, як чума, туберкульоз, сказ, кір.
Зараз для культивації вірусів в основному використовуються окремі тканинні культури і курячі ембріони. За допомогою різних маніпуляцій живі клітини заражаються, в них відбувається дозрівання вірусних тіл, які потім виходять за клітинне простір. Дозрілі віруси збираються біологами для подальшого вивчення.
